本文講述了如何將單柱層析轉化為雙柱層析（MCSGP）用于純化治療性寡核苷酸，從而顯著(zhù)提高產(chǎn)品的收率以及生產(chǎn)效率。
采用2根相同的層析柱，將第1根層析柱洗脫下的低純度組分回收到第2根層析柱繼續純化，可同時(shí)保證純度和收率。在本例中，單柱層析的收率僅為60%，而MCSGP在滿(mǎn)足目標純度要求前提下的收率則高達94%，顯著(zhù)優(yōu)于單柱層析。MCSGP工藝開(kāi)發(fā)，是通過(guò)Contichrom HPLC系統的MCSGP向導軟件來(lái)實(shí)現的。
介紹
化學(xué)合成的寡核苷酸已廣泛應用于DNA測序、聚合酶鏈反應（PCR）和分子克隆。寡核苷酸的未開(kāi)發(fā)潛力在于其以靶向方式修飾基因表達的能力，從而為人類(lèi)疾病帶來(lái)新的、有效的治療效果。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，寡核苷酸已成為繼小分子、多肽和蛋白質(zhì)藥物之后的主要開(kāi)發(fā)藥物之一，預計寡核苷酸藥物將很快應用于以往無(wú)法治療的遺傳疾病上。鑒于寡核苷酸的合成成本較高，收率的增加將會(huì )對生產(chǎn)的經(jīng)濟性產(chǎn)生重大好處。
治療性寡核苷酸的生產(chǎn)過(guò)程需要去除合成副產(chǎn)物，以使藥物純度符合要求，一般需采用層析方法進(jìn)行精純，但這通常會(huì )使收率降低40-60%。作為對策，可以將純度較低的產(chǎn)品單獨收集，并選擇再次進(jìn)行層析提純，但這會(huì )明顯降低生產(chǎn)效率，而且會(huì )增加分析檢測的工作量。因此，迫切需要有更先進(jìn)的層析手段來(lái)提高收率，并替代現有的層析方法。
MCSGP（Multi-column Counter-current Solvent Gradient Purification）可同時(shí)保證高純度和高收率，有結果表明，與單柱層析相比，MCSGP可在滿(mǎn)足目標純度的前提下，使產(chǎn)品收率提高至90%。因此，MCSGP克服了單柱層析時(shí)收率和純度無(wú)法兼得的問(wèn)題，并且由于收率的提高，通常還可保證更高的生產(chǎn)效率和更低的溶劑消耗量。
MCSGP原理
圖1. 傳統單柱層析（左）：重疊組分被舍棄或暫時(shí)保留以再次進(jìn)行層析。
MCSGP（右）：將重疊組分進(jìn)行循環(huán)回收，不斷去除雜質(zhì)，收集純產(chǎn)品。
與單柱層析不同，MCSGP是使用2根相同的層析柱進(jìn)行連續層析（圖1）。然而，兩者的分離原則是基本一致的，即在層析過(guò)程中，都將樣品分離得到3部分：純產(chǎn)物、雜質(zhì)和產(chǎn)物的重疊組分、僅含雜質(zhì)的部分。收集純產(chǎn)物部分，舍棄或重新處理含有雜質(zhì)的重疊組分。如果將重疊組分舍棄，會(huì )使有價(jià)值的產(chǎn)物發(fā)生損失。對重疊組分進(jìn)行再處理會(huì )積累雜質(zhì)，因此適用性受到限制。此外，將重疊組分暫時(shí)保留并再次進(jìn)行層析會(huì )降低整體生產(chǎn)效率。MCSGP通過(guò)內部回收（recycle）重疊組分，反復分離雜質(zhì)和純產(chǎn)物，從而同時(shí)保證純度和收率。組分的回收過(guò)程是自動(dòng)完成的，不需要進(jìn)行離線(xiàn)分析。重疊組分從一個(gè)層析柱轉移到另一個(gè)層析柱，并在每個(gè)cycle中會(huì )有新的樣品再次上柱。這樣可以確保連續操作，并在不影響純度的情況下獲得高收率的產(chǎn)品。
?
材料和方法
在30%氨水中制備治療性寡核苷酸，最終濃度為45 g/L，并通過(guò)反相HPLC測得純度為73.8%（圖2）。
圖2. 上樣樣品反相層析分析圖譜
反相層析方法：采用單柱層析和雙柱MCSGP純化寡核苷酸，兩種模式均通過(guò)Contichrom HPLC 30層析系統進(jìn)行操作，并記錄280 nm處紫外吸收值。使用2個(gè)內徑0.77 cm、柱床高度10 cm的Hiscreen Q Sepharose FF柱（柱體積為2×5 mL）。溶劑為25 mm NaOH（A相）和25 mm NaOH+2 M NaCl（B相）。對于單柱層析，每次上樣量為每mg填料上樣1 mL。產(chǎn)品洗脫采用在線(xiàn)性梯度從10%B到90%B進(jìn)行24 CV（柱體積）。共進(jìn)行3次單柱層析操作，1次作為性能基準（Benchmark），2次作為MCSGP設計的基礎。
圖3. ChromIQ軟件Batch向導界面
?
單柱（Batch）方法是使用Batch向導創(chuàng )建的，如圖3所示。表1為單柱層析參數。
?
表1. 單柱層析參數比較。方法名稱(chēng)中的數字（150&300）對應洗脫流速。
?
Benchmark使用20cm床高進(jìn)行。運行MCSGP時(shí)，使用10cm床高的層析柱2根，以保證在recycle步驟中2柱串聯(lián)時(shí)的總高度不超過(guò)20cm。因此，僅運行單個(gè)10 cm層析柱的步驟（洗脫、清洗、CIP、再生）可以在2倍至3倍的線(xiàn)性流速下進(jìn)行，而不超過(guò)層析柱的壓力限制。這將會(huì )轉化為更高的生產(chǎn)效率。采用10cm層析柱進(jìn)行單柱層析，洗脫流速為300cm/h（Batch Run 300），作為MCSGP設計的基礎。分段收集，并采用HPLC對各分段組分進(jìn)行分析檢測，以生成準確的純度曲線(xiàn)，從而快速實(shí)施MCSGP。
單柱層析結果
圖4和圖6為單柱層析圖譜。使用反相HPLC測定各洗脫組分的純度，并用超微量分光光度計測定各洗脫組分的濃度（圖5和圖7）。
圖4. Benchmark：Contichrom系統單柱層析圖譜（黑色：A280nm；藍色：電導率）
?
圖5. Benchmark：洗脫組分檢測結果
圖6. Batch Run 300（用于MCSGP設計）：Contichrom系統單柱層析圖譜（黑色：A280nm；藍色：電導率）
?
圖7. Batch Run 300：洗脫組分檢測結果
?
這兩種單柱層析的詳細過(guò)程參數比較見(jiàn)表5。在要求目標純度>91%的情況下，與Benchmark的20cm床高相比，采用10cm床高可產(chǎn)生更高的生產(chǎn)效率，這是因為10cm床高可使用更高的線(xiàn)性流速。然而，Batch Run 300的收率會(huì )比Benchmark低5%，這是因為滿(mǎn)足純度要求的收集范圍較窄。
MCSGP設計
可以單柱層析結果為基礎，通過(guò)MCSGP向導生成雙柱MCSGP方法（見(jiàn)圖8）。Contichrom系統的ChromIQ軟件可提供MCSGP向導功能。MCSGP采用與單柱層析相同的層析柱、溶液體系和相同的層析方案。
圖8. MCSGP向導：以單柱層析圖譜為基礎，整個(gè)MCSGP設計過(guò)程可在15分鐘內完成。
?
在STEP1中，需要將單柱層析圖譜加載到MCSGP向導（圖9）。在STEP2中，需要將檢測得到的各洗脫組分純度和濃度結果與單柱層析圖譜進(jìn)行疊加。
圖9. MCSGP向導界面
?
在STEP3中，通過(guò)拖動(dòng)不同顏色區域的邊界，將層析圖譜劃分為純產(chǎn)物（Product）、重疊組分（Recycle）以及雜質(zhì)（Waste）（圖9和圖10）?？捎上到y軟件模擬計算得到收集樣品的純度，并可根據區域劃分的變化自動(dòng)進(jìn)行更新。
圖10. MCSGP向導STEP3示意圖，其中包括Recycle區域（A-B為藍色，C-D為綠色）和Product區域（B-C為紅色）
?
圖9和圖10突出顯示了三個(gè)區域，分別為1個(gè)Product區域（紅色）和2個(gè)Recycle區域（藍色和綠色）。MCSGP過(guò)程具體如下：
A：產(chǎn)品洗脫出峰時(shí)開(kāi)始進(jìn)行回收（Recycle）；
B：產(chǎn)品純度達到90%時(shí)開(kāi)始收集目標物（Product）；
C：產(chǎn)品純度低于90%時(shí)結束收集目標物，并再次開(kāi)始回收（Recycle）；
D：產(chǎn)品洗脫完畢，結束回收。
在STEP4中，可設定層析柱規格及上樣體積。MCSGP所使用的2根層析柱的規格型號、裝填高度均與單柱層析時(shí)相同。MCSGP向導會(huì )根據紅色區域與藍色、綠色區域的面積比例，自動(dòng)調整上樣量，確保工藝穩定。
在STEP5中，輸入與單柱層析相同的層析工藝參數，MCSGP向導會(huì )自動(dòng)計算出稀釋因子，從而保證回收組分被稀釋后可與層析柱再次結合。
在STEP6中，MCSGP向導可以模擬計算出相關(guān)工藝參數并進(jìn)行顯示，包括產(chǎn)品純度、生產(chǎn)效率、上樣量、溶液消耗量以及收集樣品的濃度，并可設定cycle次數。此外，MCSGP向導還可自動(dòng)生成 start-up和shut-down方法。整個(gè)MCSGP設計過(guò)程可在15分鐘內完成。
分別以150 cm/h、300 cm/h和450 cm/h的洗脫流速進(jìn)行了3次MCSGP運行，以保證在層析柱耐壓范圍內進(jìn)行工藝測試，見(jiàn)表2。
表2. MCSGP方法參數比較。方法名稱(chēng)中的數字（150、300和450）對應洗脫流速。
MCSGP操作
圖11為MCSGP Run 150層析圖譜，此為MCSGP的典型圖譜。層析圖譜顯示了2根層析柱可交替進(jìn)行洗脫操作。2根層析柱在每個(gè)cycle中各會(huì )完成一次洗脫。
ChromIQ軟件還可以將連續過(guò)程（如MCSGP）的多個(gè)cycle進(jìn)行疊加（圖12）。疊加圖譜表明從cycle2開(kāi)始進(jìn)入穩態(tài)。
圖11. MCSGP Run 150層析圖譜，共顯示5個(gè)cycle
圖12. MCSGP純化寡核苷酸的疊加圖譜，共5個(gè)cycle。該圖顯示出洗脫曲線(xiàn)的變化很小，洗脫峰也很相似。第1組洗脫產(chǎn)物來(lái)自柱2（藍色曲線(xiàn)），第2組洗脫產(chǎn)物來(lái)自柱1（紅色曲線(xiàn)）。
?
每個(gè)cycle會(huì )進(jìn)行2次收集，每柱各1次。檢測表明，每個(gè)cycle的產(chǎn)量、濃度、純度均一致。圖13為MCSGP的5個(gè)cycle分析圖譜疊加。HPLC檢測結果顯示，三種不同洗脫流速的MCSGP產(chǎn)品純度均高于91%的目標閾值，每次均運行5個(gè)cycle，見(jiàn)表4。
圖13.寡核苷酸反相分析圖譜，5個(gè)cycle的疊加顯示出一致的產(chǎn)品質(zhì)量。此圖為MCSGP Run 150的結果，三種不同洗脫流速的MCSGP檢測結果相似。
?
表3為MCSGP Run 300的5個(gè)cycle工藝參數與MCSGP向導模擬計算結果的對比。實(shí)測數據與模擬計算結果接近，說(shuō)明可以在單柱層析結果的基礎上，將MCSGP向導作為數據預測工具使用。
表3. MCSGP Run 300工藝參數與MCSGP向導模擬計算結果的對比
?
單柱層析與MCSGP工藝對比
從收率、純度、生產(chǎn)效率、產(chǎn)品濃度和溶液消耗等方面對單柱層析和雙柱MCSGP進(jìn)行了計算和比較，MCSGP在各方面均表現出明顯優(yōu)勢（表5）。
將采用20cm床高的Benchmark與采用10cm床高的單柱模式（Batch Run 150和Batch Run 300）進(jìn)行了對比，與預測情況相同，較短層析柱的收率會(huì )明顯低于較長(cháng)的層析柱，這是因為較短的層析柱分辨率較低。然而，如果不考慮收率，就生產(chǎn)效率而言，較短的層析柱優(yōu)勢更明顯，尤其是在使用較高流速時(shí)。與采用20cm床高的Benchmark相比，采用10cm床高的單柱模式（共2根層析柱，累計床高20 cm）收率會(huì )從60%降至55%，但生產(chǎn)效率會(huì )提高3倍。
MCSGP的主要優(yōu)點(diǎn)是在目標純度大于91%的前提下，與所有單柱模式相比，產(chǎn)品收率可顯著(zhù)提升。按照測試流速，在92%純度要求前提下，MCSGP收率可比Benchmark單柱模式高出50-57%，詳見(jiàn)表5、圖12和圖14。MCSGP收率也顯著(zhù)優(yōu)于10cm床高的單柱模式。
在生產(chǎn)效率方面，MCSGP的優(yōu)點(diǎn)是在洗脫時(shí)可運行比Benchmark更高的流速，這是因為柱床高度降低了一半，層析柱反壓更低。這意味著(zhù)，與Benchmark相比，MCSGP可使生產(chǎn)效率翻倍，而保證收率仍高于90%（圖15）。將MCSGP直接與10cm床高的單柱模式進(jìn)行比較，發(fā)現10cm床高的單柱模式生產(chǎn)效率更高。首先，與MCSGP相同，10cm床高的單柱模式支持采用更高的流速。其次，與MCSGP不同，10cm床高的單柱模式?jīng)]有2柱串聯(lián)的步驟，因此避免了采用較低流速的過(guò)程。最后，由于MCSGP的recycle功能，每cycle的新樣品上樣量都會(huì )受限，本例中，每cycle的新樣品上樣量約為單柱模式的50%。實(shí)際上，對于許多大規模的寡核苷酸生產(chǎn)來(lái)講，收率增加5%比生產(chǎn)效率提高3倍更具有經(jīng)濟意義，這是因為寡核苷酸的合成成本很高（見(jiàn)表 5 Benchmark與Batch Run 300對比）。事實(shí)上，由于MCSGP在提高收率方面優(yōu)勢明顯，預計提高收率部分所產(chǎn)生的價(jià)值將迅速抵消購買(mǎi)連續流設備的成本投入（見(jiàn)文獻Müller-Sp?th, T., & Bavand, M. (2019). Purification of Synthetic Peptides by Countercurrent ?Chromatography (MCSGP)-Economic Evaluation. Pharmaceutical Engineering,? 39(2), 68–77）。因此，應該把提高純化收率作為本研究的主要目的。
表4. 三種不同洗脫流速MCSGP結果對比
?
表5. 單柱層析與MCSGP運行過(guò)程對比
?
圖14. MCSGP（三角形）和單柱層析（圓形）帕累托曲線(xiàn)。
該圖表明，MCSGP有效克服了單柱層析時(shí)收率和純度無(wú)法兼得的問(wèn)題。
?
圖15. MCSGP（三角形）和單柱層析（圓形）收率-生產(chǎn)效率對比圖
總結
與單柱層析相比，MCSGP在寡核苷酸純化方面具有明顯優(yōu)勢。主要包括：
1.?????? MCSGP可使寡核苷酸收率提高50%以上。在要求產(chǎn)品純度為92%時(shí)（目標純度大于91%），單柱層析的收率為60%，而MCSGP的收率可高達90%。
2.?????? 寡核苷酸收率的提高可顯著(zhù)降低上游寡核苷酸合成的工作量及成本投入。
3.?????? 與Benchmark相比，MCSGP可使生產(chǎn)效率翻倍。
4.?????? 大幅度減少了送檢樣品數量。（MCSGP每cycle需要上樣2次，但僅產(chǎn)生1個(gè)送檢樣品，而單柱層析每次上樣都會(huì )產(chǎn)生多個(gè)送檢樣品。）
5.?????? 其它工藝參數與單柱層析接近。
通過(guò)MCSGP提高生產(chǎn)效率，可應用于多種生產(chǎn)方式：
1.?????? 可采用更小規格的層析柱，在相同的時(shí)間內，完成與單柱層析相同的生產(chǎn)任務(wù)；
2.?????? 可采用與單柱層析相同規格的層析柱，在更短的時(shí)間內完成生產(chǎn)任務(wù)；
3.?????? 層析填料體積相同時(shí)，可在相同時(shí)間內獲得更多的產(chǎn)品。
層析系統介紹
Contichrom HPLC：Contichrom HPLC是一套多用途的制備型實(shí)驗室級層析系統，可運行多種單柱和雙柱層析。ChromIQ是Contichrom系統的操作軟件，其中包括MCSGP向導功能。
?
EcoPrime Twin HPLC ：EcoPrime Twin HPLC為生產(chǎn)型連續流層析系統，可在GMP條件下運行MCSGP功能，滿(mǎn)足MCSGP工藝的有效線(xiàn)性放大。
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
北京慧德易專(zhuān)注于層析領(lǐng)域十余年，已將世界領(lǐng)先的Contichrom雙柱連續流層析技術(shù)引進(jìn)中國，并已于2017年在北京昌平生命科學(xué)園蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心成立慧德易實(shí)驗室&培訓中心，現已成功舉辦多期連續流技術(shù)培訓班。
??
北京慧德易實(shí)驗室&培訓中心可為廣大客戶(hù)提供工藝開(kāi)發(fā)、產(chǎn)品展示及培訓服務(wù)，歡迎廣大客戶(hù)蒞臨指導！
? ?北京慧德易科技有限責任公司
? ?咨詢(xún)電話(huà)：010-59812370/1/2/3
? ?公司官網(wǎng)：m.abiturient24.com
? ?郵??? 箱：sales@prep-hplc.com
? ?微信公眾號：北京慧德易
