Part one 多糖
多糖（Polysacharides，PS），又稱(chēng)多聚糖，是由10個(gè)以上的單糖通過(guò)苷鍵連接而成的，具有廣泛生物活性的天然大分子化合物。它廣泛分布于自然界高等植物、藻類(lèi)、微生物（細菌和真菌）與動(dòng)物體內。20世紀60年代以來(lái)，人們逐漸發(fā)現多糖具有復雜的、多方面的生物活性和功能：
(1) 多糖可作為廣譜免疫促進(jìn)劑，具有免疫調節功能，能治療風(fēng)濕病、慢性病毒性肝炎、癌癥等免疫系統疾病，甚至能抗AIDS病毒。如甘草多糖具有明顯的抗病毒和抗腫瘤作用，黑木耳多糖、銀杏外種皮多糖和蘆薈多糖可抗腫瘤和增強人體免疫功能。
(2) 多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗輻射，增強免疫功能等生物學(xué)作用，麥冬多糖具有降血糖及免疫增強作用，動(dòng)物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能。
(3) 多糖能控制細胞分裂和分化，調節細胞的生長(cháng)與衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用，銀杏外種皮粗多糖具有抗衰老、抗過(guò)敏、降血脂、止咳祛痰、減肥等功能。
一、粗多糖的制備
生物體中的多糖，通過(guò)用熱水提取，乙醇沉淀，色素和蛋白的去除，最終獲得精制的粗多糖，下邊是對關(guān)于精制粗多糖的具體介紹。
1.1? 多糖的提取
表1 顯示的是從真菌、藻類(lèi)和高等植物中提取制備粗多糖的過(guò)程?？傮w而言， 從真菌、藻類(lèi)和植物中提取多糖的方法以水提法為主，也有采用酶解的方法進(jìn)行提取，但是還是存在一些差異。對于真菌而言，需要先發(fā)酵，然后用不同溫度的熱水進(jìn)行提取。對于植物，則根據提取部位不同，如根、莖、葉、果皮、果肉、種子或整個(gè)植物，方法略有差異。比如從莖、葉子、果皮和整棵植株中提取多糖，由于這些部位常含有色素和一些脂類(lèi)物質(zhì)，所以在提取前，常會(huì )選擇用乙醇、丙酮、甲醇或石油醚進(jìn)行預處理，以便除去一些脂類(lèi)、色素和小分子物質(zhì)，然后再用熱水進(jìn)行提取。相比而言， 果肉和根部所含色素等小分子物質(zhì)較少，則常常直接用髙溫的水進(jìn)行提取。對于藻類(lèi)，因其中也會(huì )含有不同類(lèi)型的色素，也會(huì )先用有機溶劑去除色素和小分子物質(zhì)， 然后再用熱水進(jìn)行提取。表1顯示真菌、藻類(lèi)和高等植物的多糖的沉淀劑大多是乙醇，也有個(gè)別采用丙酮。
表1 粗糖的制備
屬類(lèi) | 研究對象 | 粗糖的制備 |
真菌 | 大杯香菇 | 熱水提取→Sevag法去除蛋白→乙醇沉淀→冷凍干燥 |
冬蟲(chóng)夏草 | 熱水提取→乙醇沉淀→活性炭去色素→Sevag法去除蛋白 →乙醇沉淀→冷凍干燥 | |
杏鮑菇 | 沸水提取→乙醇沉淀→冷凍干燥 | |
植物 | 荷葉 | 95%乙醇去除小分子→沸水提取→乙醇沉淀 →Sevag法去除蛋白→冷凍干燥 |
心葉青牛膽 | 甲醇去除小分子→丙酮沉淀→三氯乙酸去除蛋白 | |
石斛粉末 | 丙酮和甲醇去除小分子→熱水提取→乙醇沉淀 | |
荔枝果肉 | 乙醇去除小分子→熱水提取→乙醇沉淀→冷凍干燥 | |
龍葵 | 石油醚和乙醇去除小分子→蒸餾水提取→乙醇沉淀 | |
藻類(lèi) | 海帶 | 石油醚去除小分子→熱水提取→乙醇沉淀 →Sevag法去除蛋白→透析→冷凍干燥 |
動(dòng)物 | 烏賊墨汁 | 上清液用木瓜蛋白酶酶解蛋白→沸水使酶失活 →Sevag法去除蛋白→乙醇沉淀 |
1.1? 多糖中雜質(zhì)的去除
粗多糖中往往混雜著(zhù)蛋白質(zhì)、色素、低聚糖等雜質(zhì)，必須分別除去。
1.1.1????????? 蛋白質(zhì)的去除
去除蛋白質(zhì)常用的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶解法等。其中以Sevag法最常用，Sevag試劑是由一定比例的氯仿和正丁醇試劑組成，通常選擇氯仿:正丁醇＝4:1（v/v）。為了將蛋白盡可能多的去除，往往需要數次重復操作。另外，該方法很難將結合蛋白去除，往往是除去蛋白的同時(shí)，多糖也損失掉了。因而采用Sevag法去除蛋白存在以下幾個(gè)缺點(diǎn)：（1）有機試劑用量大；（2）試劑毒性大，污染嚴重；（3）效率低等缺點(diǎn)。近年， 有些研究者采用酶解和經(jīng)典方法相結合來(lái)去除蛋白，該方法是在提取的過(guò)程中先加入合適的蛋白酶，將蛋白和多糖分離開(kāi)，再采用Sevag法去除蛋白，該方法既提高了多糖的提取率， 又減少了有機溶劑的使用。
1.1.2????????? 色素的去除
從生物體內提取的多糖，尤其是從植物的莖、葉和果皮中提取的多糖往往含有大量的色素，這些色素嚴重影響著(zhù)多糖的品質(zhì)。目前，去除這些色素的的方法主要有三種：（1）通過(guò)柱層析的方法進(jìn)行去除色素，例如大孔樹(shù)脂羅門(mén)哈斯的FPA98Cl。（2）通過(guò)吸附法去除色素， 例如活性炭。（3）通過(guò)氧化法去除色素，例如低濃度的H2O2。
1.1.3????????? 小分子的去除
??? 盡管在從生物體中提取多糖時(shí)，很多研究者選擇用乙醇、丙酮、甲醇或石油醚進(jìn)行預處理，但是經(jīng)過(guò)乙醇沉淀，蛋白和色素的去除后，多糖中依然存在很多小分子，尤其是一些無(wú)機鹽、單糖和寡糖。對于無(wú)機鹽、單糖和寡糖等小分子物質(zhì)， 可以采用透析法、超濾法等去除。
二、多糖的分離和純化
經(jīng)過(guò)前期對多糖的提取，去除蛋白質(zhì)、色素、小分子等物質(zhì)得到粗多糖，而這些粗多糖其實(shí)是由很多分子量、結構不同的多糖混合而成。為了得到純的多糖即均一性多糖，仍需進(jìn)一步對這些粗多糖進(jìn)行分離純化。
2.1 分步沉淀法
多糖的結構和分子量不同，其極性大小不同，在有機溶劑（ 如醇或酮）中的溶解度不同，根據這一原理，可以依此增加醇濃度，從而將多糖按分子量從大到小的沉淀出來(lái)。但是分級沉淀法一般得不到均一性多糖。仍需要借助柱層析法等進(jìn)一步純化，方可得到均一性的多糖。
2.2 柱層析法
要獲得均一性的多糖，一般是先經(jīng)過(guò)陰離子交換柱進(jìn)行粗步純化，然后再用凝膠柱進(jìn)一步純化。有些多糖也采用大孔樹(shù)脂柱進(jìn)行純化。下面對這三種柱層析法進(jìn)行詳細介紹。
2.2.1 陰離子交換法
一般使用陰離子交換柱對真菌、藻類(lèi)和高等植物的多糖進(jìn)行初步分離。陰離子交換色譜常用的介質(zhì)有DEAE-纖維素、DEAE-瓊脂糖凝膠、DEAE-葡萄糖凝膠。最常用的有DEAE-52和DEAE-Sepharose。例如用DEAE-52柱對大杯香菇等菌類(lèi)、玉米等植物、桑黃等藻類(lèi)粗多糖進(jìn)行分離純化。使用DEAE-52填料進(jìn)行多糖的初步分離純化，該柱子一般直徑偏大， 其中以2.6cm最多，操作過(guò)程中流動(dòng)相的流速也較快，流速一般在0.7-2ml/min之間，以1ml/min最多，至于柱子的長(cháng)度，選擇范圍較廣，從25-100cm不等。DEAE-Sepharose柱也常被用在對菌類(lèi)、植物和藻類(lèi)粗多糖的初步分離純化中，在選擇層析柱的直徑、流速和長(cháng)度的方面與DEAE-52相似。DEAE-52或DEAE-Sepharose柱的流動(dòng)相都是純水和不同濃度的NaCl溶液。
2.2.2 凝膠色譜法
凝膠色譜法根據被分離組分尺寸大小與凝膠的孔徑關(guān)系實(shí)現分離，類(lèi)似于分子篩的作用。常用的凝膠有葡聚糖凝膠（Sephadex?G）、Sephadex LH-20、聚丙烯酸凝膠Toyopearl HW等。多糖的進(jìn)一步分離往往會(huì )選擇用各種凝膠進(jìn)行分離純化。選擇使用哪一種凝膠對多糖進(jìn)行純化的標準是多糖的分子量，不同種類(lèi)和型號的凝膠能夠分離多糖類(lèi)型和分子量范圍不同。凝膠柱的柱子規格常具有長(cháng)而細的特點(diǎn)，直徑以1.6cm偏多。無(wú)論什么類(lèi)型的凝膠柱，流動(dòng)相多為蒸餾水或者一定濃度的NaCl溶液。
東曹的Toyopearl HW填料骨架為含羥基的親水性聚甲基丙烯酸樹(shù)脂，由于不含糖基，與其他做多糖的填料相比，不會(huì )和糖類(lèi)樣品發(fā)生非特異性相互作用。
2.2.3 大孔樹(shù)脂柱色譜
大孔樹(shù)脂柱色譜是利用大孔樹(shù)脂的選擇性吸附作用和分子篩作用分離純化多糖。比如用AB-8大孔樹(shù)脂從青錢(qián)柳葉中分離純化出均一性多糖。
2.3 超濾法
超濾是以壓力為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)，應用膜分離原理將小分子溶質(zhì)和溶劑除去而留下大分子溶質(zhì)， 從而使大分子物質(zhì)得到純化。
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表2 粗糖的進(jìn)一步分離純化
屬類(lèi) | 對象 | 填料 | 流動(dòng)相 | 獲得的多糖 |
真菌 | 大杯香菇 粗多糖 | DEAE-52(2.6×30cm) → Sephadex G-100(2.6×60cm) | H2O, 0.3,0.45M NaCl→ 0.1M NaCl | 均一性多糖LGPS-1 |
杏鮑菇 粗多糖 | DEAE-52(2.6×40cm) → Sephadex G-100 (1.3×50cm) | H2O，0.2,0.3,0.5M NaCl →H2O | 均一性多糖IPS-1和IPS-2 | |
植物 | 荷葉粗多糖 | DEAE-52(2.5×50cm) → Sephadex CL-6B (2.5×100cm) | H2O → 0.1M NaCl | 均一性多糖LLP |
荔枝果肉粗糖 | DEAE-52(2.6×60cm) → Sephadex G-100 (2.0×40cm) | H2O，0.1,0.2,0.3M NaCl →H2O | 均一性多糖 LP1,LP2,LP3 | |
藻類(lèi) | 桑黃粗多糖 | DEAE Sepharose FF(2.6×40cm) → Sephacryl S-400 HR (1.5×60cm) | 0-0.2M NaCl →H2O | 均一性多糖 PL-A11 |
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三、多糖的HPLC分析
通常情況下，使用尺寸排阻的柱子，用于多糖的分析。
四、多糖純化分析的設備
? ? 多糖是由糖苷鍵結合的糖鏈，至少要超過(guò)10個(gè)以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物，這類(lèi)物質(zhì)的一個(gè)顯著(zhù)特點(diǎn)是幾乎都沒(méi)有紫外吸收，或者很弱，在檢測手段上有它的獨特方法。
1、多糖純化系統針對多糖沒(méi)有紫外吸收的特點(diǎn)特別選配原裝進(jìn)口Shodex示差折光檢測器和Rheodyne 7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥，保證系統的靈敏度和穩定性。
2、輸液泵選配高精度柱塞泵，采用電子阻尼控制（Electrical Dump Control）和多點(diǎn)流量校正技術(shù)，有效控制流量脈動(dòng)，保證最低基線(xiàn)噪聲和流量的精準。
設備特點(diǎn)：
Part two 單糖和寡糖
??? 下面繼續把單糖和寡糖的分離純化也做個(gè)簡(jiǎn)單的介紹。
糖類(lèi)化合物的分析包括三個(gè)步驟，提取、純化和分析。在糖提取的步驟中，選擇水、稀釋的堿溶液和有機溶劑在不同的溫度下對糖樣品進(jìn)行提取，提取溶劑的選擇需要根據目標成本的類(lèi)型來(lái)確定。糖純化的過(guò)程可以使用萃取、分級沉淀、鹽析、衍生、酶解、水解、柱色譜（包括纖維素、離子交換樹(shù)脂、凝膠、HPLC法等）方法。糖分析中，最常用的方法是色譜分離（包括氣相色譜法、毛細管電泳和液相色譜法）并與合適的檢測技術(shù)聯(lián)用（包括紫外、示差、蒸發(fā)光散射、質(zhì)譜和核磁共振等）。
??? 由于糖類(lèi)的提取和純化都是類(lèi)似的，前面做了詳細的介紹，所以單糖和寡糖的提取和純化步驟，這里就不再累述了，重點(diǎn)說(shuō)說(shuō)單糖和寡糖的高壓制備和HPLC分析。
一、高壓制備設備
QuikSep 制備型中高壓層析系統根據流速范圍有50 ml/min至3000ml/min，根據客戶(hù)對產(chǎn)品制備量的要求，來(lái)選擇不同型號的系統。
1. QuikSep?系列純化系統秉承天然產(chǎn)物純化系統的所有優(yōu)點(diǎn)，并根據合成產(chǎn)物的特性，要求大量、快速的處理樣品，因此在輸液泵選擇上選用流量更高的型號；
2、輸液泵單向閥選用特有的PTFE材料，對石油醚、乙酸乙酯、丙酮、氯仿等一些強有機溶劑耐受性更好，更適合正相體系！
二、單糖、寡糖類(lèi)樣品制備填料的選擇----FUJI CHROMATOREX NH SG Silica Gel
迄今為止，大多數糖類(lèi)的分離介質(zhì)僅僅局限在分析級別，但是富士硅膠研發(fā)出用于制備色譜的新的氨基硅膠。當使用高水相為流動(dòng)相時(shí)，一般的氨基填料會(huì )暴露出很多問(wèn)題。氨基硅膠的pH值很高，一般pH為9.0，在這樣高的pH條件下，目標化合物一般都會(huì )變性，并且會(huì )毀壞硅膠基質(zhì)的表面?？紤]到這些問(wèn)題，富士公司研發(fā)出新的氨基硅膠填料，稱(chēng)之為NH SG硅膠。NH SG硅膠可以最小化甚至是避免上述問(wèn)題，并且對糖類(lèi)化合物進(jìn)行更好的分離。
眾所周知，NH官能團會(huì )和酮或者羧基發(fā)生反應。但是，NH SG硅膠填料可以在有機相/水的流動(dòng)相體積下分離大多數的糖類(lèi)化合物，而不發(fā)生上述化學(xué)反應。NH SG硅膠在正相條件下使用，尤其是親水相互作用模式（HILIC）。作為典型的HILIC模式，在增加水相比例的條件下，洗脫增強。
1. 單糖和二糖的分離
2. 寡糖的分離
2-1 寡糖的制備
三、單糖和寡糖的HPLC分析
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